IPTG (આઇસોપ્રોપીલ-β-D-થિઓગાલેક્ટોસાઇડ) એ β-ગેલેક્ટોસિડેઝ સબસ્ટ્રેટનું એનાલોગ છે, જે ખૂબ જ ઇન્ડ્યુસિબલ છે. IPTG ના ઇન્ડક્શન હેઠળ, ઇન્ડ્યુસર રિપ્રેસર પ્રોટીન સાથે એક સંકુલ બનાવી શકે છે, જેથી રિપ્રેસર પ્રોટીનનું સ્વરૂપ બદલાય, જેથી તે લક્ષ્ય જનીન સાથે જોડાઈ ન શકે, અને લક્ષ્ય જનીન કાર્યક્ષમ રીતે વ્યક્ત થાય. તો પ્રયોગ દરમિયાન IPTG ની સાંદ્રતા કેવી રીતે નક્કી કરવી જોઈએ? શું જેટલું મોટું છે તેટલું સારું?
સૌપ્રથમ, ચાલો IPTG ઇન્ડક્શનના સિદ્ધાંતને સમજીએ: E. coli ના લેક્ટોઝ ઓપેરોન (તત્વ) માં ત્રણ માળખાકીય જનીનો, Z, Y, અને A હોય છે, જે અનુક્રમે β-galactosidase, permease અને acetyltransferase ને એન્કોડ કરે છે. lacZ લેક્ટોઝને ગ્લુકોઝ અને ગેલેક્ટોઝમાં અથવા એલો-લેક્ટોઝમાં હાઇડ્રોલાઇઝ કરે છે; lacY પર્યાવરણમાં રહેલા લેક્ટોઝને કોષ પટલમાંથી પસાર થવા દે છે અને કોષમાં પ્રવેશ કરે છે; lacA એસીટીલ જૂથને એસિટિલ-CoA થી β-galactoside માં સ્થાનાંતરિત કરે છે, જેમાં ઝેરી અસરને દૂર કરવાનો સમાવેશ થાય છે. વધુમાં, એક ઓપરેટિંગ સિક્વન્સ O, એક પ્રારંભિક સિક્વન્સ P અને એક નિયમનકારી જનીન I છે. I જનીન કોડ એક રિપ્રેસર પ્રોટીન છે જે ઓપરેટર સિક્વન્સની સ્થિતિ O સાથે જોડાઈ શકે છે, જેથી ઓપેરોન (મેટા) દબાઈ જાય છે અને બંધ થઈ જાય છે. પ્રારંભિક સિક્વન્સ P ના ઉપરના ભાગમાં કેટાબોલિક જનીન એક્ટિવેટર પ્રોટીન-CAP બંધનકર્તા સાઇટ માટે એક બંધનકર્તા સાઇટ પણ છે. P ક્રમ, O ક્રમ અને CAP બંધનકર્તા સાઇટ મળીને lac ઓપેરોનનો નિયમનકારી ક્ષેત્ર બનાવે છે. જનીન ઉત્પાદનોની સંકલિત અભિવ્યક્તિ પ્રાપ્ત કરવા માટે ત્રણેય ઉત્સેચકોના કોડિંગ જનીનો સમાન નિયમનકારી ક્ષેત્ર દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે.
લેક્ટોઝની ગેરહાજરીમાં, લાખ ઓપેરોન (મેટા) દમનની સ્થિતિમાં હોય છે. આ સમયે, PI પ્રમોટર સિક્વન્સના નિયંત્રણ હેઠળ I સિક્વન્સ દ્વારા વ્યક્ત કરાયેલ લાખ ઓપેરોન (મેટા) O સિક્વન્સ સાથે જોડાય છે, જે RNA પોલિમરેઝને P સિક્વન્સ સાથે જોડાતા અટકાવે છે અને ટ્રાન્સક્રિપ્શન શરૂઆતને અટકાવે છે; જ્યારે લેક્ટોઝ હાજર હોય છે, ત્યારે લાખ ઓપેરોન (મેટા) પ્રેરિત કરી શકાય છે. આ ઓપેરોન (મેટા) સિસ્ટમમાં, વાસ્તવિક પ્રેરક પોતે લેક્ટોઝ નથી. લેક્ટોઝ કોષમાં પ્રવેશ કરે છે અને β-ગેલેક્ટોસિડેઝ દ્વારા એલોલેક્ટોઝમાં રૂપાંતરિત થવા માટે ઉત્પ્રેરિત થાય છે. બાદમાં, એક પ્રેરક પરમાણુ તરીકે, રિપ્રેસર પ્રોટીન સાથે જોડાય છે અને પ્રોટીન રચનામાં ફેરફાર કરે છે, જે O સિક્વન્સ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનમાંથી રિપ્રેસર પ્રોટીનનું વિયોજન તરફ દોરી જાય છે. આઇસોપ્રોપીલથિઓગાલેક્ટોસાઇડ (IPTG) એલોલેક્ટોઝ જેવી જ અસર ધરાવે છે. તે ખૂબ જ શક્તિશાળી પ્રેરક છે, જે બેક્ટેરિયા દ્વારા ચયાપચયિત થતું નથી અને ખૂબ જ સ્થિર છે, તેથી તેનો પ્રયોગશાળાઓમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.
IPTG ની શ્રેષ્ઠ સાંદ્રતા કેવી રીતે નક્કી કરવી? ઉદાહરણ તરીકે E. coli લો.
પોઝિટિવ રિકોમ્બિનન્ટ pGEX (CGRP/msCT) ધરાવતા E. coli BL21 ને આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ સ્ટ્રેન તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, જે 50μg·mL-1 Amp ધરાવતા LB પ્રવાહી માધ્યમમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને 37°C પર રાતોરાત કલ્ચર કરવામાં આવ્યું હતું. ઉપરોક્ત કલ્ચરને વિસ્તરણ કલ્ચર માટે 1:100 ના ગુણોત્તરમાં 50μg·mL-1 Amp ધરાવતા 50mL તાજા LB પ્રવાહી માધ્યમની 10 બોટલોમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને જ્યારે OD600 મૂલ્ય 0.6~0.8 હતું, ત્યારે IPTG અંતિમ સાંદ્રતામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. તે 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 છે. સમાન તાપમાને અને તે જ સમયે ઇન્ડક્શન પછી, તેમાંથી 1 મિલી બેક્ટેરિયલ દ્રાવણ લેવામાં આવ્યું હતું, અને બેક્ટેરિયલ કોષોને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પર વિવિધ IPTG સાંદ્રતાના પ્રભાવનું વિશ્લેષણ કરવા માટે SDS-PAGE ને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી સૌથી મોટી પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ સાથે IPTG સાંદ્રતા પસંદ કરવામાં આવી હતી.
પ્રયોગો પછી, એવું જાણવા મળશે કે IPTG ની સાંદ્રતા શક્ય તેટલી મોટી નથી. આનું કારણ એ છે કે IPTG માં બેક્ટેરિયા માટે ચોક્કસ ઝેરી અસર હોય છે. સાંદ્રતા કરતાં વધુ થવાથી કોષનો નાશ પણ થશે; અને સામાન્ય રીતે કહીએ તો, આપણે આશા રાખીએ છીએ કે કોષમાં જેટલું દ્રાવ્ય પ્રોટીન વ્યક્ત થશે તેટલું સારું, પરંતુ ઘણા કિસ્સાઓમાં જ્યારે IPTG ની સાંદ્રતા ખૂબ વધારે હોય છે, ત્યારે મોટી માત્રામાં સમાવેશ થશે. શરીર, પરંતુ દ્રાવ્ય પ્રોટીનનું પ્રમાણ ઘટ્યું. તેથી, સૌથી યોગ્ય IPTG સાંદ્રતા ઘણીવાર જેટલી મોટી હોય તેટલી સારી હોતી નથી, પરંતુ સાંદ્રતા ઓછી હોય છે.
આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ સ્ટ્રેન્સના ઇન્ડક્શન અને ખેતીનો હેતુ લક્ષ્ય પ્રોટીનની ઉપજ વધારવાનો અને ખર્ચ ઘટાડવાનો છે. લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિ ફક્ત સ્ટ્રેનના પોતાના પરિબળો અને અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડથી જ નહીં, પરંતુ અન્ય બાહ્ય પરિસ્થિતિઓ, જેમ કે પ્રેરકની સાંદ્રતા, ઇન્ડક્શન તાપમાન અને ઇન્ડક્શન સમય દ્વારા પણ પ્રભાવિત થાય છે. તેથી, સામાન્ય રીતે, અજાણ્યા પ્રોટીનને વ્યક્ત અને શુદ્ધ કરવામાં આવે તે પહેલાં, યોગ્ય પરિસ્થિતિઓ પસંદ કરવા અને શ્રેષ્ઠ પ્રાયોગિક પરિણામો મેળવવા માટે ઇન્ડક્શન સમય, તાપમાન અને IPTG સાંદ્રતાનો અભ્યાસ કરવો શ્રેષ્ઠ છે.
પોસ્ટ સમય: ડિસેમ્બર-૩૧-૨૦૨૧